浅谈美迪西抗体药物PK剖析方法学买卖的考虑关键

原标题：浅谈美迪西抗体药物PK分析方法学设计的考虑要点

单克隆抗体药物进入体内有着多个可能的存在形式：游离型、部分结合型、完全结合型。抗体药物体内的多种存在形式使得其PK分析方法学设计较为复杂，如何考虑待测分子形式，如何针对性地设计出合适的Assay Format，实践中又也许会出现什么样的问题和挑战，接下来由美迪西生物药物分析部主任章登吉博士为您解析。

美迪西生物技术药物分析团队在生物技术药的药代动力学、毒代动力学、免疫原性及生物标志物相关的分析与评价以及基因重组、单克隆抗体制备方面有着丰富的理论基础和实践经验，有能力承接从原材料制备到分析的全流程一站式服务。由章登吉主任带领的生物分析团队具有过硬的专业素质，核心成员兼具深厚的研发背景并熟知GLP、GCP/GCLP等相关法规流程。章登吉主任主攻方向为大分子药物与细胞基因治疗药物的分析与评价，具有13年多的临床和临床前生物技术药物分析经验，负责过Novartis, Pfizer, Lilly, J&J, Genentech, Medimmune, Takeda，石药集团等多家医药企业的多类型生物药相关分析评价工作。

当前生物治疗性产品中抗体药物占主要部分，截至2017年，已经有60多个单抗药物获批上市，2017年全球销售额排名前10的药中，有8个是大分子药物，这8个中单抗药就占6个，目前超500种抗体药物处于临床开发阶段，国内外抗体药物开发的热度近几年来持续上升。这些抗体产品大多数都是IgG亚型的单克隆抗体。IgG是具有两个抗原结合价的抗体亚型，这种二价性使得抗体药物在体内有多种可能的存在形式：二价的即游离型抗体（mAbfree），单价的即部分结合的抗体（Partial bound mAb），结合了两个抗原的抗体即完全结合的抗体(Total bound mAb)。在进行血药浓度检测时，需要仔细考虑是否有循环的、可溶性的抗体药物靶向结合的配体分子(Ligand,L)存在，从而明确其多种可能的存在形式。如果抗体药物靶向结合的配体是一个二聚体甚至多聚体，抗体药物的存在形式可能更为复杂。鉴于抗体药物体内存在形式的多样性，可靠的分析方法学是支持PK/PD研究，评估剂量-反应关系，评价有效性和安全性的关键。

基于配体结合分析(Ligand Binding Assay, LBA)技术，设计不同的分析模式（Assay Format）可以选择性地检测所感兴趣的抗体药物分子形态，然而在进行方法学设计前，研究者应该明确其所希望检测的药物存在形式，游离的、部分结合的、完全结合的、还是所有可能的存在形态（mAbtotal）？这要根据数据使用目的、不同的药物开发阶段等因素考虑。在许多情况下，mAbfree决定抗体药物作为生物治疗性产品的药理学效应；但mAbtotal却能帮助阐明mAb与靶向配体分子间的动态相互作用和影响，尤其是当它的靶向配体分子作为一个PK/PD模型中最直接的药效生物标志物时。药代动力学研究者通常关注于游离性抗体（mAbfree），因为它们反映了活性药物的利用度，然而毒理学研究人员可能会倾向于检测所有的药物形式（mAbtotal），因为mAb药物的脱靶效应或靶向效应都有可能引起毒性相关的安全问题。在临床前早期阶段的一些筛选性PK研究中，从节约时间、成本或特异性的关键试剂一时难以获得等因素考虑，能够使用述针对human IgGFc的 “Generic Assay format”检测来自于非人种属的PK样品，即以抗human IgGFc的抗体作为捕获和检测试剂, 像Gyros公司还专门开发有应用于IgG类治疗性蛋白临床前PK的评价的Generic Assay试剂盒，一款试剂盒可运用于常见的非人种属PK样品检测。

利用抗体的靶向配体分子即靶点分子作为捕获试剂，以抗Human IgGFc的抗体作为检测试剂的配对夹心模式是一种较为方便和节约的Assay Format设计（参见图1）。这种Assay Format可以检测两种形态的抗体药物，即部分结合的抗体（Partial bound mAb）与游离抗体(mAbfree)，但不能检测到完全结合的抗体，因此无法定量mAbtotal。若目标基质中明确不可能存在游离靶点的干扰或mAb*L复合物，运用此种Assay Format进行PK检测的确是一种便利的途径，且此时检测抗体形式也仅可能是游离抗体（mAbfree）。游离靶点的存在，和给药后mAb*L复合的形成，靶点的蓄积会干扰此Assay Format对mAbtotal的检测，但有研究人员提出将mAb*L酸化解离的方法使所有结合型mAb变成游离的形式，进而达到基于此Assay Format能检测mAbtotal的目的。也有研究人员将此办法来进行改造，即采用包被有Streptavidin的固相材料，并将用于捕获的靶点分子进行Biotin标记与酸化处理的样品同步加入反应体系中达到尽可能定量mAbtotal的目的，这样的操作流程类似于ADA检测的Bridge ELISA检测模式（参见图２）。

图1：靶点捕获测游离与部分结合的抗体

图2：基于图一的改造型靶点捕获法

抗独特型单克隆抗体是一种能够识别、结合另一抗体可变区的抗体，在抗体药物的药代动力学分析上有较多的应用。在某一个特定的抗体分子中，其可变区中特异性的抗原表位部分，被称为抗体的独特位（idiotope）。对于某一个特定的抗体，存在着多个独特位区域：有些独特位和该抗体的抗原结合互补位完全重合；有些独特位位于可变区的互补位之外；而另外一些独特位，除了互补位之外，还包括了可变区上其它序列。一个抗体分子中所有独特位和互补位统称为该抗体的独特型（参见图３）,针对于某一个抗体分子独特型部分的抗体，被称为抗独特型抗体（Anti-idiotype Atibody，Anti-id）。与抗原结合互补位结合的抗独特型抗体具有抑制性或中和性，不与抗原互补位结合的抗独特型抗体不具有抑制性和中和性。采用不同的抗独特型抗体设计出不同的Assay Format可以针对性地检测到各种形式的单克隆抗体药物，即游离、部分结合或完全结合抗原的单克隆抗体。

图3：抗体的独特型与独特位

以非抑制性的抗独特型抗体(Non-inhibitory Anti-id)作为捕获试剂，并以非抑制性的抗独特型抗体或抗Human IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）作为检测试剂可以检测所有的抗体形式（mAbtotal）(参见图４,图5)。以抑制性抗体(Inhibitory Anti-id) 或靶点分子分别作为捕获试剂、检测试剂配对模式构建桥式ELISA（Bridge ELISA），甚至靶点分子和抑制性抗体(Inhibitory Anti-id)配对使用可实现仅能检测到游离型抗体药物。（参见图6）。以抑制性的抗独特型抗体捕获试剂，非抑制性的抗独特型抗体(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）作为检测试剂可以检测游离和部分结合的单价抗体（参见图7）。将抑制性的抗独特型抗体或靶点分子作为捕获试剂，采用标记mAb药物与样品中非标记mAb药物竞争结合固相抗体的方法也可以检测游离和部分结合的单价抗体，将此种方法的捕获试剂替换为非抑制性的抗独特型抗体也可以检测总的抗体药物（mAbtotal），但竞争性的方法更较为难以获得好的稳健性。

图4：基于Non-inhibitory Anti-id和抗Hu IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）检测mAbtota

图5：基于Non-inhibitory Anti-id作为捕获和检测试剂检测mAbtotal‘’

图6：基于靶抗原分子配对作为捕获和检测试剂检测mAbfree

(说明:设计时将图中的捕获抗原和检测抗原换成抑制型抗独特型抗体，或其中一个抗原替代为抑制性抗独特型抗体均可实现仅检测mAbfree ，不再一一图示)

图7：以抑制性和非抑制性抗独特型抗体分别为捕获和检测试剂检测mAbfree和单价抗体

对于结合型抗体药物（部分结合和完全结合）的检测，也能够使用与抗体药物不具竞争性的抗靶点的抗体作为捕获试剂，以非抑制性的抗独特型抗体(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）作为检测抗体的构成的Assay Format进行仔细的检测（图8）。也有文献指出，在样品中添加过量的游离靶向配体分子将mAb转变成mAb*L从而尽可能实现此Assay Format对mAbtotal的定量。

图8：以非抑制性抗靶点抗体为捕获试剂检测完全结合和部分结合抗体

前述不同Assay Format中的检测抗体能够准确的通过灵敏度需要或检测模式的需要将HRP标记替换为其它不同的分子进行标记。虽然不同的Assay Format可以针对性地实现PK样品中不同抗体药物形式的检测，但在实践中仍然可能面临许多挑战和问题值得思考。1）如抗独特型抗体虽然可以较好地利用于PK生物分析中，但其制备和筛选有一定的周期和难度，更加消耗成本。2）酸化解离和将游离mAb转化为mAb*L虽可以将对mAb部分形态检测的Assay format应用于mAbtotal的检测分析，但酸化后的样品在加入中和液后解离开的靶点分子还是可能与用于捕获的靶点分子进行竞争，因此给操作上增加了控制难度，解离后的复合物存在着又结合回去的可能，酸化是一种促进检测的新方法对游离靶点的耐受性手段，但用于定量检测的准确性还需要看方法的优化程度；抗原抗体反应具有可逆性，是一个动态平衡的过程，而游离mAb即使在过量的靶向配体分子存在下也不可能全部转化为mAb*L，此过程对mAbtotal定量的偏差程度需要有效控制在一定的范围内，有其实践中的复杂性。3）实践中我们首先或更容易获得的配制PK样品分析标准曲线的是mAbfree，游离的标准品制备的标准曲线在定量检测结合型抗体完全合适吗？含有与游离mAb标准品等摩尔浓度或等质量浓度的抗体分子成分的mAb*L复合物在检测过程中的反应能力和产生的信号强度一致吗？是不是有必要进行两者的间的校正或要另外制备mAb*L复合物标准品呢？

另外，如果靶点配体分子与药物结合外还可能与其它分子结合时，方法上如何设计和优化；如果靶点分子是二聚体或多聚体又会对PK分析产生什么样的挑战；抗体药物作为大分子药物具有潜在的免疫原性，这又会对PK分析产生什么样的影响等等没有列入此文的讨论范围。随着各学科的发展，新的检测技术出现和实践的深入，未来对各种形态的抗体分子检测会更加游刃有余。

美迪西生物技术药物分析部门拥有SpectraMaxM4/M5/i3x, MSD, Luminex, Biacore 8K, Envision, Gyrolab，ABI7500 qPCR等全方位多功能的技术平台，利用LIMS系统实施全面的实验室信息化管理，提供全面符合FDA/CFDA/OECD GLP规范要求的生物技术药物分析服务。

美迪西生物技术药物分析部的科研团队可灵活运用ELISA，ECL，IP，Co-IP，qPCR，FACS，Elspot,酶学等多种方法，支持前沿生物药，种类包括蛋白、抗体（单抗、双或多特异性抗体、抗体片段）、ADC、多肽、核酸、疫苗及细胞基因治疗药物的早期开发，及其临床前研究和临床研究，已开发并验证针对不同靶点，如CD-4，CTI-4，PD-1，PD-L1及T-DM1类似物ADC等的分析方法，支持PK/TK/免疫原性(Total ADA, Nab)/生物标志物/细胞因子等分析。

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